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基本信息

項目名稱:
微生物毒素AFB1誘導小鼠肝臟病變過程中相關蛋白功能研究
小類:
生命科學
簡介:
黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉(A.flavors)和寄生曲霉(A.parasiticus)等產毒菌種產生的次生代謝產物,其中黃曲霉毒素B1是現在發現的毒性和致癌性最強的天然污染物。
詳細介紹:
黃曲霉毒素(Aflatoxins)是黃曲霉(A.flavors)和寄生曲霉(A.parasiticus)等產毒菌種產生的次生代謝產物,其中黃曲霉毒素B1是現在發現的毒性和致癌性最強的天然污染物。本研究通過蛋白質組學、生物信息學、分子生物學等多種實驗手段結合起來研究黃曲霉毒素B1誘導表達的肝臟蛋白的功能。研究用黃曲霉毒素B1,處理小白鼠和細胞, 結果發現AFB1不僅會造成小白鼠發病 ,也會造成細胞不同程度上的損傷。運用雙向電泳找出小鼠發病后肝臟的差異蛋白質,經質譜分析得到蛋白的氨基酸序列,用生物信息學軟件分析預測其結構及功能,結果發現30個蛋白質點變化差異顯著。分析其中7個明顯上調和下調的蛋白質點,其中有4個蛋白可能屬于引發小鼠肝臟發生病變或癌變的蛋白質點,另外3個蛋白可能參與小鼠肝臟能量與物質的代謝。結果表明,這些蛋白對小鼠肝臟都有著很大的影響 。 選取其中與腫瘤關系較大基因atp5b進行研究,利用熒光定量PCR技術分析atp5b在免疫小鼠肝臟中的動態變化情況,結果與雙向電泳的結果基本一致。為了進一步研究atp5b的細胞生物學功能,本研究構建過表達載體pCDNA3.1(-)-atp5b、RNA干擾載體pGPU6/GFP/neo-shRNA,通過脂質體轉染到哺乳動物細胞中,G418篩選獲得穩定表達細胞株。研究發現,AFB1處理會引起細胞中atp5b含量的降低;而在atp5b過表達的體系中,在缺氧條件下,細胞增殖率變小,生長緩慢;在atp5b干擾的細胞系中,MTT法檢測細胞增殖能力,發現設計的3個shRNA片段中shRNA1、shRNA2組細胞增殖率大于1,shRNA3組細胞增殖率小于1;干擾apt5b后細胞耐受AFB1的能力降低。本研究進一步驗證了atp5b對細胞生物學行為的影響,也將為闡明腫瘤細胞中ATP合成酶的功能提供了理論依據。

作品圖片

  • 微生物毒素AFB1誘導小鼠肝臟病變過程中相關蛋白功能研究
  • 微生物毒素AFB1誘導小鼠肝臟病變過程中相關蛋白功能研究
  • 微生物毒素AFB1誘導小鼠肝臟病變過程中相關蛋白功能研究

作品專業信息

撰寫目的和基本思路

黃曲霉毒素,是現在發現的毒性和致癌性最強的天然污染物。目前國內外在黃曲霉毒素致毒機理方面的研究大都缺乏系統性,這對深入全面地了解黃曲霉毒素的毒理作用,對其誘發的腫瘤進行標本兼治很不利的。本研究通過比較正常和病理情況下蛋白質在肝臟中表達差異,能夠同時發現與病理改變有關的一系列疾病特異性蛋白質,并通過蛋白質組學、生物信息學、分子生物學等多種實驗手段結合起來研究黃曲霉毒素誘導的小鼠肝臟相關蛋白的功能。

科學性、先進性及獨特之處

本研究以昆明鼠作為模式動物,大大降低了試驗成本,同時結合多種試驗方法研究黃曲霉毒素誘導的小鼠肝臟蛋白的功能。將為今后生物毒素研究搭建了一個較理想的平臺 。

應用價值和現實意義

本研究從感染老鼠開始到定位特異蛋白在經典發病途徑中的作用,是國內外首次系統的對污染農產品的黃曲霉毒素的致毒機理進行研究。 本研究將為系統地揭示黃曲霉毒素誘導疾病的發生機制鋪平道路,為完善疾病的發生通路提供有益信息,為疾病的診斷提供新的分子標記,同時為肝癌的治療和藥物開發提供了一些新的思路。

學術論文摘要

本研究用黃曲霉毒素B1,處理小白鼠和細胞,發現AFB1會造成小白鼠發病,同時會造成細胞不同程度上的損傷。然后運用雙向電泳找出小鼠發病后肝臟的差異蛋白質,經質譜分析得到蛋白的氨基酸序列,用生物信息學軟件分析預測其結構及功能。結果發現30個蛋白質點變化差異顯著,分析其中7個明顯上調和下調的蛋白質點。其中有4個蛋白可能屬于引發小鼠肝臟發生病變或癌變的蛋白質點,另外3個蛋白可能參與小鼠肝臟能量與物質的代謝。這些蛋白對小鼠肝臟都有著莫大的影響。 本研究選取其中與腫瘤關系較大基因atp5b進行研究,先利用熒光定量PCR分析其在免疫小鼠肝臟中的動態變化情況,結果與雙向電泳的結果基本一致。然后構建過表達載體和RNA干擾載體,通過脂質體轉染到哺乳動物細胞中,用以研究atp5b的細胞生物學功能。研究發現,AFB1處理會引起細胞中atp5b含量的降低;在atp5b過表達的體系中,缺氧條件下,細胞增殖率變小,生長緩慢;在atp5b干擾的細胞系中,MTT法檢測細胞增殖能力,發現設計的3個shRNA片段中shRNA1、shRNA2組細胞增殖率大于1,shRNA3組細胞增殖率小于1。本研究進一步驗證了atp5b對細胞生物學行為的影響,也將進一步闡明在腫瘤細胞中ATP合成酶的功能提供了條件。

獲獎情況

鑒定結果

參考文獻

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同類課題研究水平概述

在天然污染的糧食中以黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最大,量也最多,致癌性也最強,它屬于肝臟毒素,能誘發肝癌。雖然AFB1的致癌機制由于缺乏直接的證據而一直不能充分肯定,但是許多相關研究表明黃曲霉毒素,特別是AFB1于肝癌的發生確實有莫大的關系。研究顯示,AFB1進入體內后由于具有親肝性首先在肝細胞內聚積,隨后在細胞色素P450系統作用下轉變為8,9-環氧AFB1 (AFB1-8,9-epoxide,AFBO),催化這一代謝的關鍵酶為細胞色素P450,該酶正好主要存在于肝細胞內。在P450 3A4作用下的形成exo-AFBO為人類所知的具有基因毒性和致癌性的AFB1代謝產物。AFB1的基因毒性之一是誘發DNA損傷和導致基因突變。AFBO能和DNA分子共價結合形成AFB1-DNA,這一加合物的形成是其發揮基因毒性的關鍵步驟。目前關于黃曲霉毒素致癌的分子機制已經有了一個大概的輪廓,但在其致癌過程中所涉及的具體效應分子還不是很清楚。秦雪等人用雙向電泳等技術建立樹鼩肝癌實驗模型,并對PrxⅡ蛋白的差異表達進行了驗證,證實該蛋白在肝癌組織中的蛋白表達及基因表達水平均較癌前組織明顯上調。Domenico C等在其研究中應用組織芯片技術檢測到骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)高度表達于多種惡性腫瘤細胞質,其表達與這些腫瘤的病理分級存在密切聯系表明,OPN在腫瘤演進中發揮了重要作用。肝癌的發生和發展是多因素、多基因參與的病理過程其機制錯綜復雜,如何評價某種蛋白在該病理過程中所起的作用還需進一步驗證。
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